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高效液相色谱法测定抱茎苦荬菜中木樨草素及芹
中南数字出版网(www.zhipr.net)  核心期刊·推荐发表  全国最受欢迎的医学期刊网 时间:2013-07-20

                   作者:张晶 佟全胜 董金平 田义新 石磊岭

【摘要】  目的建立了同时测定抱茎苦荬菜中木樨草素和芹菜素含量的高效液相色谱(HPLC)方法。方法Nucleosil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱柱,以甲醇-水(56∶44)为流动相;流速为1.0 ml·min-1;检测波长为349 nm;柱温为25 ℃。结果木樨草素在0.034 4~0.172 mg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系,R2=0.999 3,平均回收率为98.23%,RSD为1.17%;芹菜素在0.01~0.16 mg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系,R2=0.999 3,平均回收率为97.16%,RSD为1.36%。结论此法简便快速,结果准确可靠、重复性好,可用于药材中木樨草素与芹菜素含量的同时测定。

【关键词】  高效液相色谱法 抱茎苦荬菜 木樨草素 芹菜素

 抱茎苦荬菜Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance为菊科(Compositae)苦荬菜属(Ixeris)植物,别名为苦碟子、满天星等,盛产于我国东北、华北等地。据《内蒙古中草药》记载,抱茎苦荬菜味苦、辛,具清热解毒、排毒、止痛之功效[1]。民间主要用于治疗阑尾炎、扁桃体炎、无名肿痛等症[2]。在以往的质量标准中只有测定腺苷的含量,其中重要的有效成分黄酮类却没有准确可靠的含量测定方法[2]。抱茎苦荬菜中富含黄酮类化合物,木樨草素和芹菜素即为其中的代表性成分。据报道[3],木樨草素是一种很具有代表性的天然黄酮,在植物界分布较广。其具有很强的抗氧化[4]、抗菌、抗病毒及降血压、降血脂作用[5]。芹菜素可抑制多种肿瘤的发生、发展,此外,还具有抗炎症、降血压、抗动脉硬化和血栓症、抗焦虑、抗菌、抗病毒以及抗氧化等多方面的生物学活性,而且其致畸变毒性与其他黄酮类化合物相比相对较低[6]。

    木樨草素和芹菜素均为抱茎苦荬菜中的主要成分,含量较高,但目前的研究只有针对其中某一种成分的含量测定方法。彭缨等[2]采用 RP-HPLC 法对抱茎苦荬菜药材中木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量进行了测定;程春萍等[7]采用反相高效液相法对中华苦荬菜中的木樨草素进行了含量测定。本文建立了HPLC法同时测定抱茎苦荬菜中木樨草素及芹菜素的含量的条件,以甲醇∶水(56∶44)为流动相,其中不加酸,选用的检测波长为349 nm。并用此条件测定了不同采收期抱茎苦荬菜中木樨草素及芹菜素的含量。现报道如下。

    1   仪器与药品

    岛津LC-2010高效液相色谱仪;SPD-10Avp紫外检测器;LC-Solution色谱工作站;紫外可见分光光度计(岛津2450);KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

    木樨草素对照品购买于中国药品生物制品检定所,批号111520-200201;芹菜素对照品于实验室提供(纯度为98%以上)。甲醇为色谱纯(美国Fisher公司),水为纯水(经UPWS超纯水器纯化,杭州永洁达净化科技有限公司)。

    抱茎苦荬菜由通化华夏药业提供,经吉林农业大学胡全德教授鉴定确认为正品。

    2  方法与结果

    2.1   色谱条件的选择 色谱柱为Nucleosil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相为甲醇-水(56∶44);流速1.0 ml·min-1;检测波长349 nm;柱温25℃;进样量20 μl。

    2.2   对照品溶液的制备

    2.2.1  木樨草素对照品溶液的制备精密称取木樨草素标准品8.6 ㎎,置于10 ml的容量瓶中,加甲醇使溶解,并稀释至刻度,制成0.86 ㎎/ml木樨草素对照品溶液。

    2.2.2  芹菜素对照品溶液的制备 精密称取芹菜素标准品2.0 mg,置于2ml的容量瓶中,加甲醇使溶解,并稀释至刻度,制成1.00 mg/ml芹菜素对照品溶液。

    2.3  供试品溶液的制备 精密称取样品粉末2.00 g,置具塞三角瓶中,加90%乙醇50.0 ml,超声提取30 min/次,共提取3次,过滤,浓缩,用甲醇定容于10 ml的容量瓶中,备用。

    2.4   线性关系考察

    2.4.1   木樨草素线性关系精密吸取“2.2.1”项制备的木樨草素对照品溶液0.20,0.40,0.60,0.80,1.00 ml于5 ml的容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,各进样20 μl,按“2.1”项色谱条件测定峰面积。以木樨草素进样量X为横坐标,峰面积Y为纵坐标制标准曲线,计算得回归方程为Y=3.00×107X-52 458, R2=0.999 3。结果表明木樨草素在0.034 4~0.172 mg/ml范围内与峰面积具有良好的线性关系。

    2.4.2   芹菜素线性关系精密吸取“2.2.2”项制备的芹菜素对照品溶液50 ,100 ,200,400,800 μl于5 ml的容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,各进样20 μl,按“2.1”项色谱条件测定峰面积。以芹菜素进样量X为横坐标,峰面积Y为纵坐标制标准曲线,计算得回归方程为Y=2.01×107X-32 617, R2=0.999 3。结果表明芹菜素在0.01~0.16 mg/ml范围内与峰面积具有良好的线性关系。

    2.5   精密度实验在相同的“2.1”项色谱条件下,取同一采收期同一部位的抱茎苦荬菜药材粉末(30目)2 g,按“2.3”项操作,制备样品溶液。分别精密吸取20 μl,连续进样5次,测定色谱峰面积。结果表明测定方法具有良好的重复性,木樨草素 RSD=2.87%(n=5);芹菜素 RSD=0.57%(n=5)。

    2.6  重复性实验将供试品溶液在0,2,4,6,8,12,24 h连续取样7次,木樨草素重复性 RSD=0.13%(n=6);芹菜素重复性 RSD=3.51%(n=6)。结果表明,测定方法具有良好的重复性。

    2.7   加样回收率实验精密称取2.5 g已知含量(含木樨草素为0.022 65 %,芹菜素为0.003 482 %)的抱茎苦荬菜样品,6份,分别精密加入一定量的木樨草素对照品溶液(含0.56 mg)和芹菜素对照品溶液(含0.08 mg)。按“2.3”项制备供试品溶液,进行加样回收率考察测定。木樨草素加样平均回收率为98.23%, RSD=1.17%(n=6);芹菜素加样平均回收率为97.16%, RSD=1.36%(n=6)。

    2.8   样品的测定采用上述HPLC法测定了不同采收期抱茎苦荬菜全草中木樨草素及芹菜素的含量。结果见表1。 表1  不同采收期抱茎苦荬菜全草中木樨草素及芹菜素的含量

    3   讨论

    3.1   检测波长的选择本实验采用紫外分光光度计(岛津2450)在200~400 nm波长范围内测定了木樨草素、芹菜素甲醇溶液的紫外吸收光谱,结果显示,两者在260 nm和349 nm均有最大吸收。因349 nm处吸收较强,本实验采用349 nm作为检测波长。

    3.2   色谱条件的选择木樨草素和芹菜素均属于黄酮类化合物,因此应加入酸类物质,可以有效改善拖尾的现象。但考虑到酸类物质对色谱柱的影响,且流动相的配置较为繁琐,本文在分析过程中,未加入酸类物质,经过条件筛选,分离效果也很好,两者与其他物质都达到了相互的基本分离,峰形虽然稍微有点拖尾,但不影响分析,测定结果稳定。见图1~3。

    本实验采用HPLC法对不同采收期的抱茎苦荬菜中木樨草素及芹菜素的含量同时进行了测定,从结果可以看出,抱茎苦荬菜全草中的两种黄酮含量均在6月14日达到最高点。此结果的出现应该与不同生育期抱茎苦荬菜体内的生理活动状态有关。

    本实验的方法与以往只是针对抱茎苦荬菜中的单一成分进行考察的测定方法相比,更具有科学性。同时检测两个主要黄酮成分含量更科学地衡量抱茎苦荬菜的质量,方法简便、快速、准确,重复性好,可以为抱茎苦荬菜的质量控制和合理采收提供科学依据,也适用于其他药材中此两种黄酮成分含量的同时测定。

【参考文献】
  [1] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海人民出版社, 1977:1300.

[2] 彭 缨,张 梅,宋少江.抱茎苦荬菜药材中木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的分离与含量测定[J].沈阳药科大学学报,2006,23(8):518.

[3] 北京医学院,北京中医学院.中草药成分化学[M].北京:人民出版社,1983:279.

[4] Y.Lee.L.R Howard ,B.villabn.Flavonoids and Autioxi Dant Activity of Fresh Pepper(Capsicum annuum) Cuhivars[J].Journal of Food Science,1995,60(3):476.

[5] 王宪楷.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社, 1994:272.

[6] 孙 斌,瞿伟菁,张晓玲.芹菜素的药理作用研究进展[J].中药材,2004,27(7):531.

[7] 程春萍,任秀莲,魏琦峰.反相高效液相色谱测定中华苦荬菜中木樨草素含量[J].内蒙古石油化工,2004,30(3):19.

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