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D240阳性微淋巴管密度与直肠癌进展的关系

   【摘要】 目的 探讨直肠癌中微淋巴管密度(MLVD)、微血管密度(MVD)与淋巴结转移及其生物学行为之间的关系。方法 应用免疫组化法检测76例直肠癌和瘤周、远端切缘黏膜中D240和CD34阳性标记的微淋巴管和微血管数,并应用Western blot法检测7例直肠癌组织中D240蛋白含量。结果 直肠癌总MLVD(15.66±4.82)、前缘区MLVD(18.26±2.36)显著高于瘤周、远端切缘黏膜MLVD(5.70±2.95、6.00±3.12,P<0.05),与Dukes′s分期、淋巴结转移、淋巴管受累呈正相关关系(P<0.05)。直肠癌总MVD、前缘区MVD与Duke′s分期相关(P<0.01)。结论 微淋巴管密度,尤其在前缘区,与直肠癌的淋巴结转移及侵袭性生长有密切相关。干预直肠癌生长转移需要抑制血管生成的同时也要抑制淋巴管生成。

  【关键词】 直肠肿瘤 微淋巴管密度 微血管密度 淋巴结转移

  The relationship between D240 positive microlymph vessel density and progression of rectal carcinoma

  WANG MingFu, FENG JunWei,GAO YanMin,et al.

  Department of General Surgery,Yutian Family Planning Center,Tangshan O641OO,Hebei,China

  【Abstract】 Objective To study the relationships between micro1ympha vessel density (MLVD) marked by D240 and microvascular density (MVD) marked by CD34 and clinical biological features of rectal carcinomas.Methods MLVD and MVD were examined in 76 cases with rectal carcinomas, 42 matched adjacent normal mucosa and 76 distant normal mucosa samples by immunohistochemistry; D240 protein content in 7 primary tumors was detected by Western blot.Results MLVD in carcinoma tissue (15.66±4.82), in anterior field (18.26±2.36) was significantly higher than that in adjacent mucosa (5.70±2.95) and distant normal mucosa (6.00±3.12) (P<0.05), were positively related to Dukes stages, lymph node metastasis, lymphatic vessel invasion (P<0.05). MVD in the whole areas and marginal areas were correlated with Dukes′stage of rectal carcinomas.Conclusions MLVD, especially in the marginal areas, is associated with the lymph node metastasis and the procession of rectal adenocarcinomas. The growth and metastasis of rectal cancer could be intervened by inhibiting angiogenesis and lymphatic formation.

  【Key words】 Rectal neoplasms; Microlymphatic vessel density; Microvascular density; Lymph node metastasis

  淋巴管形成以及淋巴结癌转移是评价直肠癌预后的主要因素。但由于难以找到淋巴管内皮细胞特异性的标记物,肿瘤淋巴管的研究始终难以迅速开展。新发现的高度特异的淋巴管内皮细胞标记物D240 〔1〕,使肿瘤组织中淋巴管生成与淋巴结转移及肿瘤生物学行为关系的研究成为热点。本研究采用免疫组化法、Western blot法检测直肠癌、瘤周近端黏膜、远端黏膜中D240阳性的微淋巴管密度 (micro1ymphatic vessel density,MLVD)和CD34阳性的微血管密度(microvascular density,MVD),旨在探讨直肠癌中淋巴管形成与其生物学行为之间的关系。

  1 材料与方法

  1.1 材料 收集2000~2004年手术切除的76例直肠癌及42例瘤周、76例远端切缘黏膜组织,所有标本均经术后病理证实,瘤周肠黏膜组织来自同一病理切片上癌组织周边的黏膜组织,且无不典型增生等癌前病变。所有患者均术前未行任何治疗。76例中男46例,女30例,年龄29~83岁,平均60.1岁。分为老年组(>60岁)36例,非老年组(<60岁)40例。肿瘤直径2~13 cm,均数4.5 cm。组织学分类依据2004年WHO病理分型标准,其中高分化13例,中分化43例,低分化20例。Duke′s A期7例、B期29例、C期32例、D期8例。另收集2005年7例直肠癌及2例远端切缘黏膜新鲜组织,-80℃保存。

  1.2 免疫组织化学染色 鼠抗人D240单克隆抗体购自中杉金桥生物技术公司;CD34、二抗 EnVision 试剂盒、DAB显色试剂盒、PBS、枸橼酸均购自福州迈新生物技术公司。选取直肠癌存档蜡块,连续4 μm切片。采用免疫组化EnVision法依试剂盒提供步骤操作。用已知阳性的结直肠癌为阳性对照,PBS代替一抗为阴性对照。

  1.3 Western blot蛋白印迹法 D240鼠抗人单克隆抗体(中杉金桥生物技术公司)、其他试剂及硝酸纤维素膜均购自华美生物工程公司。冻存组织总蛋白制备和Western blot分析参照常规方法。

  1.4 结果判定 参照Weidner〔2〕方法进行微淋巴管和微血管计数,先在低倍镜(100×)下观察癌及相应黏膜组织中染色最丰富区,然后在高倍镜(400×)下分别计数,每个阳性染色的内皮细胞、内皮细胞簇或单个小脉管均视为1个微淋巴管或微血管(管径超过8个红细胞直径或者管壁有肌层的脉管不视为微淋巴管/血管)。每例计数4个视野,取其平均值为MLVD和MVD;Western blot法检测D240蛋白如在相对分子量40kD处出现阳性信号为有表达,否则为无表达;根据微淋巴管和微血管所在的肿瘤区分为总计数、中央区(脉管位于瘤巢内)、边缘区(脉管位于癌巢周围)。由于肿瘤浅表区多伴有坏死及炎性细胞浸润,本研究未进行该区脉管计数。

  1.5 统计学处理 运用SPSS 13.0统计软件进行分析,计量资料采用t检验、单因素方差分析。

  2 结果

  2.1 微淋巴管及微血管免疫组化形态观察 D240较特异性地表达在淋巴管内皮细胞、血管内皮细胞而肿瘤细胞未见表达,部分肿瘤间质的纤维及纤维母细胞可见表达。瘤周、远端切缘黏膜固有层的微淋巴管很少且散在分布,多呈条索状,无管腔;而位于黏膜与黏膜肌之间的微淋巴管多呈扩张状态。癌巢内(中央区)及外周(前缘区、浅表区)均可见微淋巴管,中央区管腔小,多为闭锁状态,前缘区、浅表区管腔较大,多为扩张。癌栓多见于前缘区扩张的淋巴管。浅表区由于坏死组织及纤维组织增生,多呈弥漫阳性。CD34阳性的微血管明显较微淋巴管丰富,分布在癌组织及瘤周、远端切缘黏膜组织中,但中央区与前缘区的微血管数量及形态无明显差别。

  2.2 直肠癌中MLVD、MVD与其临床生物学指标的关系 直肠癌中总MLVD、前缘区MLVD在Duke′s C、D期高于Duke′s A、B期、淋巴结转移组高于无淋巴结转移组,淋巴管受累组高于无淋巴管受累组(均P<0.05),总MLVD、前缘区MLVD与年龄、性别、肿瘤部位、大小、组织学类型、分化程度、浸润深度、炎细胞浸润无关(P>0.05),中央区MLVD值与直肠癌的临床病理指标未发现统计学意义(P>0.05) ,见表1。

  表1 直肠癌中MLVD、MVD与其临床生物学指标的关系(略)

  1)P<0.05

  直肠癌中MVD在Duke′s C、D期高于Duke′s A、B期(P<0.05)。MVD值与年龄、性别、肿瘤部位、大小、大体形态、组织学类型、分化程度、浸润深度、炎细胞浸润、淋巴结转移、淋巴管受累无关(P>0.05),见表1。

  2.3 正常直肠黏膜及癌组织中MLVD、MVD之间的比较 直肠癌中可以检测到D240蛋白表达100%(7/7),且多数表达较强,而黏膜表达较弱或部分缺失。癌组织中MLVD总数、前缘区、中央区均高于瘤周、远端切缘黏膜中MLVD(P<0.05)。癌组织中MVD、前缘区、中央区明显高于瘤周、远端切缘黏膜中MVD(P<0.01) ,见表2。

  表2 正常直肠黏膜及癌组织中MLVD、MVD之间的比较(略)

  与瘤周和远端切缘黏膜比较:1)P<0.05,2)P<0.01

  3 讨论

  近25年来,结直肠癌已成为我国发病率增长最快的恶性肿瘤,约30%~40% 的病例确诊时已发生远处转移。D240最初是从胎儿的睾丸和生殖细胞肿瘤中分离出的一种分子量为40kD的唾液酸糖蛋白,最初发现在卡波西肉瘤有表达,后来研究发现无论是福尔马林固定的石蜡组织还是新鲜组织中D240能高度选择性地与正常及肿瘤的淋巴管内皮反应,不与血管内皮反应〔3,4〕。本研究中D240特异性地表达在淋巴管内皮细胞,表明D240为肿瘤微淋巴管的特异性标记物。但个别病例的肿瘤性间质也见到较强的D240的表达,主要在纤维母细胞。新生微淋巴管主要集中于肿瘤前缘区,中央区最少。扩张的微淋巴管于前缘区多见,常有开放腔面,癌栓多见于该区扩张的微淋巴管内;中央区则多呈闭锁状或条索状,甚至完全缺如〔5,6〕,提示直肠癌通过前缘区扩张的淋巴管进行转移。

  本研究中直肠癌中MLVD显著高于瘤周及远端黏膜中MLVD,提示直肠癌中有大量淋巴管生成。肿瘤总MLVD、前缘区MLVD在淋巴结转移组中显著高于无淋巴结转移组,淋巴管受累组明显高于淋巴管无受累组,提示肿瘤淋巴管数量的多少与淋巴结转移和侵袭性行为密切相关,与文献报道结果类似〔7〕。本研究还发现中央区MLVD与肿瘤转移关系不密切。我们认为,肿瘤不同区域微淋巴管分布存在异质性,前缘区、中央区微淋巴管分布差异可能是由于肿瘤细胞在中央区增殖产生的高压不利于微淋巴管生成,该处的微淋巴管结构处于无功能状态。而在前缘区,肿瘤组织间压力较低,该区微淋巴管多为有功能的淋巴管,癌细胞更易侵入微淋巴管而发生转移。这与目前有研究肿瘤淋巴管生成不能促进淋巴结转移的报道不一致〔8,9〕。本研究中在正常直肠黏膜固有层内也有D240阳性的微淋巴管存在,与正常结直肠黏膜层内不存在微淋巴管的观点不同,但其机制及其生物学意义有待进一步观察。

  本研究中微血管密度仅与直肠癌的Duke′s分期有关,微血管数随着肿瘤的进展而增加。本研究中CD34阳性染色的微血管形态与分布特点基本与D240阳性标记的微淋巴管一致,但是数量远较为淋巴管多,而且在中央区数目并未明显减少。分析其原因,一方面可能是肿瘤生长更依赖于血管供应营养,尤其在肿瘤生长的初期。 另一方面有研究表明CD31阳性的脉管包括一部分淋巴管瘤和所有的血管瘤〔3〕,CD34与CD31的构成相似,CD34可能除血管外也标记了部分淋巴管。

  综上所述,直肠癌微淋巴管分布存在区域异质性,以前缘区分布最为密集,且该区微淋巴管密度增高与肿瘤淋巴结转移、侵袭性生物学行为相关。对直肠癌生长转移的干预要考虑到抑制血管生成的同时也要抑制淋巴管生成,这为抑制淋巴管生成的肿瘤治疗提供了新思路。

  【参考文献】

  1 Kahn HJ,Bailey D,Marks A.Monoclonal antibody D240,a new marker of lymphatic endothelium,reacts with Kaposi′s sarcoma and a subset of angiosarcomas〔J〕.Mod Pathol,2002;15:43440.

  2 Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors〔J〕. Breast Cancer Res Treat,1996;36:16980.

  3 Kahn HJ,Bailey D,Marks A.Monoclonal antibody D240,a new marker of lymphatic endothelium,reacts with Kaposi′s sarcoma and a subset of angiosarcomas〔J〕.Mod Pathol,2002;15:43440.

  4 Marks A,Sutherland DR,Bailey D,et al.Characterisation and distribution of an oncofetal antigen (M2Aantigen) expressed on testicular germ tumors〔J〕.Br J Cancer,1999;80:56978.

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  8 Agarwal B,Saxena R,Morimiya A,et al.Lymphangiogenesis does not occur in breast cancer〔J〕.Am J Surg Pathol,2005;29:144955.

  9 van der Schaft DW,Pauwels P,Hulsmans S,et al.Absence of lymphangiogenesis in ductal breast cancer at the primary tumor site〔J〕.Cancer Lett,2007;254:12836.


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